一、產品特點

1、連接只需5 min。

2、載體不含LacZ基因，無需藍白斑篩選。

3、優質PCR產物（無非特異性條帶、無引物二聚體）可直接進行克隆，無需純化。

二、PCR產物的制備：

1、擴增引物不能磷酸化。

2、PCR反應結束后，電泳檢測PCR產物產量和質量，若有非特異性擴增或引物二聚體，則需切膠回收目的條帶后進行克隆。

三、操作步驟

克隆反應：

1、室溫下，按下表配制反應體系：

   連接反應體系的總體積為10μl（用ddH₂O補足）。輕彈離心管將反應體系混勻，短暫離心3-5s。

   注：整個操作過程均在室溫條件下進行，切勿在冰上操作。

   如果PCR產物電泳檢測僅有很亮的目的條帶，無非特異性條帶和引物二聚體，可取0.5-1μlPCR產物原液直接進行克隆

2、將離心管于室溫（22-30℃）下靜置0-5 min（不可超過5 min）。反應結束后將離心管放置在冰上，進行后續的轉化操作。

         注：室溫下（22-30℃）反應時間不可超過5 min，時間過長克隆效率會下降。若室溫較 低，建議使用PCR儀控溫，可設置25℃反應5min。若連接產物未能立即用于轉化，需保存于-20℃。不建議對連接產物做長期保存。

3、陽性對照實驗：

取1μl試劑盒提供的對照片段進行克隆、轉化后，將菌液涂布在含有相應抗生素的培養平板上，37℃培養過夜。取菌斑進行PCR擴增。

附：不同長度的DNA片段的最適添加量參照表:

轉化（此操作需在無菌條件下進行）：

1、取5 μl連接產物加入到50-100 μl 剛剛融化的感受態細胞中（感受態細胞應剛從-80℃取出，于冰上融化，剛剛融化便加入連接產物），溫和混勻，冰浴2-30 min。

2、42℃水浴熱激30s。（勿晃動離心管）

3、立即轉移到冰上，靜置2 min（冰浴期間勿晃動離心管）。

4、加入300-500 μl LB培養基（不含抗生素），37℃，200-250 rpm振蕩培養60 min。

注：當插入片段的長度＜2 kb時，可省略復蘇步驟（步驟4），直接將轉化后的菌液涂布在含氨芐青霉素的平板上，37℃培養過夜。

5、取200 ul菌液，涂布于含氨芐青霉素的平板上，37℃培養過夜。

注：若想獲得更多克隆，可將菌液低速（3000 g）離心2 min，棄掉部分上清液，用移液器吹打至菌體完全重懸，吸取全部菌液涂布于含氨芐青霉素的平板上，37℃培養過夜。

檢測：

1、菌落PCR法（無菌操作）：

（1）挑選單菌落至10 μl無菌水中，充分混勻。

（2）取2 μl菌液作為PCR反應的模板，用試劑盒提供的M13F/M13R引物擴增插入片段。

（3）PCR反應條件

     94℃  2 min

     94℃  30 sec

     56℃  30 sec    30 cycles

     72℃  1 kb/min  （根據片段大小確定延伸時間）

     72℃  10 min

（4）電泳檢測PCR產物，若載體自連，則擴增出的片段大小為143 bp。

（5）確定重組子后將剩余的8 μl菌液轉接到LB培養基中（含相應的抗生素），搖菌培養過夜，然后提取質粒進行測序。

2、限制性酶切法：

（1）挑取單克隆至LB培養基中（含相應抗生素），過夜搖菌，抽提質粒。

（2）用EcoRI/EcoRV/PstI或合適的限制性內切酶，對質粒進行酶切，鑒定重組子。

測序：

    用M13F和M13R通用引物測序，然后進行序列分析。

       M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’

       M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’

四、常見問題分析：

重組子克隆菌少，或陽性率低：

1、感受態效率低：使用轉化效率＞5×107fcu/μg的感受態細胞；

2、連接反應在低溫下（如碎冰上）操作：應在室溫下操作；

3、連接反應時間過長：室溫下放置5min即可，時間過長效率會下降；

4、PCR產物加入量太少或太多：按照推薦量加入；

5、PCR產物純度低：重新擴增或重新純化PCR產物；

6、PCR產物質量低，切膠十紫外照射時間長：使用藍光切膠儀切膠或加快切膠速度，減少PCR產物在紫外下暴露的時間；

7、轉化后沒有做復蘇：可加入LB培養基（無抗生素）震蕩培養60min；

8、克隆基因可能對宿主菌有毒性，比如某些編碼膜蛋白和DNA結合蛋白的基因，某些啟動子和調節序列基因，或含有倒置或串聯重復序列的基因：選用室溫過夜培養平板。

附：載體圖譜