免疫組化實驗步驟

1.    石蠟切片用二甲苯脫蠟。(二甲苯各10min/次，2次)

2.    梯度酒精水化（100%以乙醇，90%乙醇，75%乙醇，50%乙醇，各5min）后，在蒸餾水中浸泡5分鐘。

3.    0.01M PBS（pH=7.4）浸泡5min/次，3次 。

4.     每張切片加1滴或50μl 過氧化酶阻斷劑（北京鼎國，DGSP-試劑1），以阻斷內源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10分鐘。

5.     0.01M PBS（pH7.4）浸泡5min/次，3次。

6.     0.01mol/L檸檬酸鹽抗原修復液（CB，pH6.0）微波爐最低檔抗原修復10min

7.     每張切片加1 滴或50μl 正常羊非免疫血清，室溫下孵育30 分鐘，封閉后不洗，吸去多余液體。

8.     每張切片加1 滴或50μl的第一抗體（1：100倍稀釋），37℃孵育60分鐘。

9.     0.01M PBS浸泡5min/次，3次。

10. 每張切片加1 滴或50μl 生物素標記的第二抗體（生物素標記山羊抗兔IgG，北京鼎國，HF005-1，1：500倍稀釋）， 37℃孵育30分鐘。

11. 0.01M PBS浸泡5min/次，3次。

12. 每張切片加1滴或50μl辣根過氧化酶標記鏈親和素溶液（1：1000倍稀釋，北京鼎國，HD009-1），37℃孵育30分鐘。

13. 0.01M PBS 浸泡5min/次，3次。

14. 每張切片加2滴或100μl新鮮配制的DAB工作液（北京鼎國，DDAB-002），顯微鏡下觀察5~30分鐘。

    15.自來水沖洗，蘇木素復染，脫水、中性樹膠封固

染色結果的觀察

1.  陽性結果應定位在細胞相應的部位，在細胞膜表達的抗原陽性結果應定位在細胞膜上，在其他部位的陽性反應均為非特異性染色。不當的抗原修復會導致抗原在組織細胞中定位的改變。根據所檢測抗原的不同，抗原分別定位在：

1）細胞膜：如LCA和CD3、CD20等；

2）細胞質：如Cytokeratin 、GFAP、S100 、CgA、AFP等；

3）細胞核：如Ki-67、ER、PR、TTF-1、HPV-Ag、Cyclin D1、TDT等。

2.  組織的周邊、氣泡、刀痕、皺折等部位往往呈現非特異性陽性表達。

3.  染色結果呈陰性并非都是抗原不表達，要考慮是否與組織中的抗原受到破壞有關。

4.  組織切片背景深與下列因素有關：

1）石蠟切片脫蠟不干凈；

2）第一抗體濃度過高或孵育時間過長，溫度過高；

3）顯色劑DAB濃度過高或H2O2太多；

4）抗體不純；

5）抗體孵育后切片清洗不干凈。