技術路線

相關問題的說明

探針的選擇

根據不同的雜交實驗要求，應選擇不同的核酸探針。在大多數情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個堿基改變時應選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交，因為它不易透過細胞膜進入胞內或核內。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標記探針（80～150bp）具有較大的優越性。

探針的標記方法

在選擇探針類型的同時，還需要選擇標記方法。但在選擇標記方法時，還應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。放射性探針的實際靈敏度不依賴于所采用的標記方法，如隨機引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性 。在檢測單拷貝基因序列時，應選用標記效率高、顯示靈敏的探針標記方法。在對靈敏度要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術和比較穩定的堿性磷酸酶顯示系統。

探針的濃度

總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經驗，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標記探針與非放射性標記探針的用量分別為5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標記物的固相支持物的非特異結合特性的影響。

雜交最適溫度

雜交技術最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應溫度。若反應溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩定的雙鏈，錯配對減少。若反應溫度再低（Tm-30℃），雖然互補鏈之間也可形成穩定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗，即最適復性溫度、苛刻復性溫度及非苛刻復性溫度。最適復性溫度（Optimunm renaturation temperature， TOR）：Tor =Tm –25℃

苛刻復性溫度：Ts = Tm – (10或15℃)

非苛刻復性溫度：Tns =Tm – (30或35℃)

雜交反應時間

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應不完成；時間長了也無益，會引起非特異結合增多。一般雜交反應要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和反應時間（t）的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應時間為21h，那么對于未標記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8，雜交完成了。對標記DN A（濃度為0.1μg/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標記DNA的自我復性。